产品货号：
LA00362
中文名称：
FITC标记试剂盒
英文名称：
FITC Antibody(protein) Labeling Kit
产品规格：
3T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒包含蛋白质标记染料和去除多余染料所需的全部组分。异硫氰酸荧光素（FITC）可以与蛋白质上的氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰基和羰基发生交联反应。然而，只有伯胺和仲胺的衍生物才能产生稳定的标记产物。反应在pH8～9下效率最高，并且必须在无胺缓冲液如硼酸盐或碳酸盐/碳酸氢盐中进行。通常，蛋白质与15至20倍摩尔数的FITC反应，可导致几个FITC分子与一个蛋白质分子结合。装填有纯化树脂的离心柱简化了柱平衡、收集和监测重力流分的步骤。该系统能够有效去除多余的FITC，从而准确测定染料与蛋白的比例（F/P）和蛋白浓度。
标记抗体或者含有伯氨的蛋白质、多肽。
保存：4℃，其中FITC需要-20℃避光保存。
本试剂盒可用于标记和纯化3次1mg (2mg/mL)或者6次0.5mg (2mg/mL)的IgG或其他蛋白质。
表一.相关参数
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- 操作简单，可在约一小时完成蛋白标记和纯化。
- 优化的F/P值。
- 无需称量微量粉末，试剂盒包含一次性试剂瓶。
- 高效的纯化试剂盒包括纯化树脂和离心柱，确保快速有效地去除未反应的染料并拥有优异的蛋白质回收率。
标记抗体或者含有伯氨的蛋白质、多肽。
| 染料 | Fluorescein (FITC) |
| 激发/发射 | 494nm/518nm |
| 标记规格 | 0.5～1mg |
| 标记目标 | 蛋白质（抗体） |
| 组分 | 规格 |
| FITC（异硫氰酸荧光素） | 1mg*3 |
| 标记缓冲液 | 5mL |
| 离心型纯化柱 | 6套 |
| 2mL离心管 | 6个 |
| 纯化凝胶(50%) | 12mL |
保存：4℃，其中FITC需要-20℃避光保存。
本试剂盒可用于标记和纯化3次1mg (2mg/mL)或者6次0.5mg (2mg/mL)的IgG或其他蛋白质。
- FITC对湿度敏感。即用即配FITC标记试剂并丢弃未使用的部分。
- 低浓度的叠氮化钠（≤3mM或0.02%）或硫柳汞（≤0.02mM或0.01%）不会显着干扰蛋白质标记。但是，20～50%的甘油会降低标记效率。
- 避免使用含伯胺的缓冲液（例如Tris，甘氨酸），因为它们与标记反应物竞争。
- 蛋白质制备
注意：如果标记缓冲液在储存期间沉淀，则通过加热并涡旋使其溶解。为获得最佳效果，使用1mg蛋白质，浓度为~2mg/mL。准备蛋白质如下：
a.在PBS中冻干的蛋白质：在使用前，用0.5mL标记缓冲液溶解1mg蛋白质。
b.PBS中的蛋白质：可以直接用来标记。如果蛋白浓度＞2mg/mL，则用标记缓冲液（50mM硼酸钠）将浓度调节至2mg/mL。
c.其他缓冲液中的蛋白质：蛋白质必须在不含铵离子或伯胺（例如Tris或甘氨酸）的缓冲液中。如有必要，用50mM硼酸钠通过透析置换缓冲体系。 - 蛋白质标记
- 将所有试剂置于室温下。
- 向FITC试剂小瓶中加入100μL DMSO，并上下晃动10次，短暂涡旋直至所有染料溶解，此时FITC浓度为10mg/ml。
注意：试剂必须完全溶解才能进行有效标记。 - 向制备的0.5mL蛋白质溶液中加入5μL步骤2的FITC溶液（10mg/ml），上下晃动并短暂涡旋混匀。
- 短暂离心，使样品汇集到收集管底部。
- 将反应混合物在室温下避光孵育60～120分钟。
- 将所有试剂置于室温下。
- 蛋白质纯化
- 将两个离心型纯化柱底部的塑料塞拧下后，置于2mL收集管中。
- 混匀纯化树脂，向两个离心型纯化柱内分别加入600μL悬液，可以通过弹击管壁的方法去除气泡。以~1000×g离心30秒以除去储存溶液。
- 重复步骤二，加入悬液的同时重悬柱内的树脂，以~1000×g离心30秒再次去除纯化树脂的储存液，使之形成致密均一的纯化柱。丢弃用过的收集管并将柱子放入新的2mL圆底离心管中。
- 向每个旋转柱中各加入250～270μL标记反应物，注意不可吹起树脂。
- 以~1000×g离心柱30～45秒以收集纯化的蛋白质。合并两个离心管中的样品（总体积约0.5mL），并丢弃使用过的离心柱。
- 向标记的蛋白质添加1%(w/v) BSA和0.02%(w/v)叠氮钠在4℃下避光可保存长达一个月。或者，将标记的蛋白质一次性分装避光储存在-20℃，避免反复冻融。
- 将两个离心型纯化柱底部的塑料塞拧下后，置于2mL收集管中。
- FITC与蛋白质比率计算
- 使用PBS对FITC标记物进行稀释，测量吸光度A280和A495
Molar F/P＝ 2.77×A495 (仅适用于FITC-IgG标记产物) A280－0.35×A495 IgG(mg/mL)＝ A280－0.35×A495 (仅适用于FITC-IgG标记产物) 1.4
其中1.4是大多数IgG在浓度为1.0mg/ml （pH7.0）的A280 - 当用于除IgG以外的蛋白质标记，可以参考下列公式进行计算：
Molar F/P＝ MW × A495/195 ＝ A495×C 389 A280－0.35×A495/E2800.1% A280－0.35×A495
其中，C＝MW×E2800.1%／389×195（C是对某一蛋白质特有的常数）；
MW标记蛋白质相对分子质量；
389 FITC相对分子质量；
195结合E2800.1%的FITC在pH=13.0时的A495；
A380－0.35×A495是对A280的吸光度校正；
E2800.1%标记蛋白质在浓度为1.0mg/ml的A280 (关于更多的E2800.1%和C值，请参考表一)；
- 使用PBS对FITC标记物进行稀释，测量吸光度A280和A495
- 蛋白质没有标记
- 蛋白质缓冲液含有干扰标记的胺：
通过透析或其他方法将缓冲液交换到50mM硼酸钠中。 - FITC变质：
即用即准备标记试剂，不要将试剂存放在水溶液中。
- 蛋白质缓冲液含有干扰标记的胺：
- 下游应用程序未成功
- 蛋白质没有标记：
通过计算FITC与蛋白质的比率来确定蛋白质是否被标记
- 蛋白质没有标记：
- 样品或缓冲液未流出
- 离心问题：
确保离心机处于正常工作状态。
- 离心问题：
- 产量低
- 离心不当：
① 确保使用指定的离心速度。
② 在树脂顶部加入40μL合适的缓冲液，重复离心步骤。 - 蛋白质不稳定：
用PBS或其他合适的缓冲液平衡柱。
- 离心不当：
表一.相关参数
| 抗体 | MW | E2800.1% | C* |
| IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 | 150,000 | 1.4 | 2.77 |
| IgA1,IgA2 | 160,000 | 1.32 | 2.78 |
| IgD | 165,000 | 1.7 | 3.70 |
| IgE | 185,000 | 1.53 | 3.73 |
| IgM | 900,000 | 1.18 | 14.0 |
| F(ab')2 | 100,000 | 1.5 | 1.98 |
| Fab' | 50,000 | 1.5 | 0.99 |
| Fc | 50,000 | 1.2 | 0.79 |
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